酒精使用障碍在全球范围内极为普遍，其特征是在戒断期间会出现严重的疼痛敏感性。
基于此，2024年9月27日中国科学技术大学生物物理与神经生物学系张智研究团队在Science Advances杂志发表了“A neural circuit for alcohol withdrawal–induced hyperalgesia in a nondependent state”揭示了非依赖状态下酒精戒断引起的痛觉过敏的神经回路。
在这里，作者建立了一个在成瘾之前酒精戒断（EW）期间痛觉过敏的小鼠模型，以研究其发病窗口和潜在机制。通过体内显微内窥镜和双光子钙成像的能技术，确定了从背侧海马CA1谷氨酸能神经元（dCA1Glu）到前扣带皮层谷氨酸能神经元（ACCGlu）的神经回路通路，该通路在EW小鼠的痛觉过敏中被激活。化学遗传学抑制这一通路可以减轻EW小鼠的痛觉过敏，而激活则在未经EW的小鼠中重现了EW诱导的痛觉过敏。这些发现表明，在小鼠对酒精产生依赖之前，dCA1Glu到ACCGlu的神经通路参与推动EW诱导的痛觉过敏。
图一 在非依赖状态下，小鼠的酒精戒断诱导痛觉过敏
以前建立酒精依赖小鼠模型的方法是通过慢性间歇性酒精暴露，动物至少接受一个月（平均）的四个重复周期的酒精蒸汽暴露，或至少连续3周自由饮用液态酒精。因此，为了探索短期饮酒戒断对小鼠疼痛敏感性的影响，作者缩短了暴露时间，建立了一个连续饮酒的小鼠模型，允许小鼠自由饮用20%的酒精两周，每六天有24小时的戒断期。在第二次戒酒酒精消耗后24小时，发现在用von Frey刺激戒酒组（EW组）小鼠右后爪时，其机械阈值显著低于对照组小鼠。相比之下，通过Hargreaves测试评估的热阈值在EW小鼠和对照组之间没有显著差异。
作者在EW期间观察到的机械阈值降低可以持续长达3天。此外，在对照组小鼠中，机械或热阈值没有观察到变化。然后作者使用旷场测试（OFT）和高架十字迷宫（EPM）测试了两周的酒精消耗戒断是否也伴随着焦虑样情感障碍，结果显示，在进入中心区域的频率或在OFT测试中运动的距离没有显著差异，在EPM测试中进入开放臂的频率或在开放臂中花费的时间也没有明显差异。为了进一步测试EW小鼠是否发展为酒精依赖或保持非成瘾状态，在第二次戒断期后两周的酒精消耗期间，对两组小鼠进行了偏好测试。EW组和对照组小鼠都表现出对蔗糖的高度偏好和对酒精的非常低的消耗，而在EW组和对照组小鼠之间，蔗糖或酒精的摄入量没有差异，这表明EW小鼠保持了与对照组小鼠相当的对蔗糖的高度偏好，在连续两周的酒精消耗后，对酒精没有明显的偏好。
此外，作者还量化了这种范式下小鼠的酒精消耗量，发现两周内酒精摄入量没有变化。还通过收集EW小鼠的尾静脉血测试了血浆酒精浓度，发现第一次和第二次戒断后血浆酒精浓度没有差异，这表明在连续酒精暴露后血浆酒精浓度保持相对稳定的状态。此外，血浆酒精浓度在2小时后逐渐降低，比第二次戒断后降低明显，并且在第二次EW后8小时无法检测到。此外，作者发现EW小鼠的体重增长趋势与对照组小鼠相比没有差异，这表明当前研究中两周的连续酒精暴露没有影响小鼠的健康状态。这些结果共同表明，两周的酒精消耗戒断可以在小鼠中诱导疼痛敏感化，而不是酒精依赖。
图二 在戒酒小鼠中dCA1Glu活性增强
海马尤其是背侧CA1区域，是大脑中对酒精敏感的目标，可能涉及与急性或慢性酒精消耗或戒断相关的疾病。为了探究dCA1在EW诱导的痛觉过敏中的作用及其机制，作者首先通过免疫荧光染色检测这一区域的c-Fos表达，结果显示与对照组小鼠相比，EW小鼠的dCA1中c-Fos信号显著增强；为了测试dCA1Glu神经元的神经兴奋性，在对照和EW转基因Thy1-黄色荧光蛋白（YFP）小鼠的脑片上进行了体外电生理记录。与对照组小鼠相比，EW小鼠的dCA1Glu神经元活性显著升高，表现为放电率增加和电流诱发的动作电位的阈值降低，而静息膜电位没有明显变化。此外，作者还进行了显微内窥镜实验，将GCaMP 6m注射到EW和对照组C57小鼠的dCA1，以在体内直观观察dCA1Glu神经元活性。EW小鼠的dCA1Glu神经元的钙活性和强度显著高于对照组。这些结果共同揭示，在小鼠形成依赖之前，短期酒精消耗戒断期间dCA1Glu神经元活性增加。
为了进一步探索dCA1Glu神经元如何参与疼痛敏感化，作者使用了化学遗传学抑制EW和对照组小鼠的dCA1Glu神经元。行为测试显示，与感染对照病毒的dCA1中的EW小鼠相比，化学遗传学抑制dCA1Glu神经元的EW小鼠的机械阈值显著升高，而化学遗传抑制dCA1Glu神经元对hM4Di-对照组小鼠的机械阈值没有影响。此外，作者还通过化学遗传学激活了未经处理的C57小鼠的单侧dCA1，在这些未经处理的小鼠中，特异性激活dCA1Glu神经元导致对侧后爪的机械阈值降低，与感染对照病毒的小鼠相比，在旷场测试的总行程没有变化。此外，根据广泛用于评估癫痫严重程度的Racine量表，作者研究了行为记录中的癫痫样行为，如口部和面部运动、头部点头、前肢阵挛、站立和跌倒，而在化学遗传学激活dCA1Glu神经元的小鼠中几乎没有观察到癫痫样行为。这些结果支持dCA1Glu神经元有助于与EW相关的痛觉过敏。
图三 戒断短期饮酒后，前扣带回谷氨酸能神经元活动增强
为了直观观察并量化dCA1Glu神经元到ACC的投射活动，作者在ACC中注射了逆行病毒并进行了全细胞膜片钳记录。结果显示，在第二次戒酒后24小时，与对照组相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神经元的放电率升高，而电流诱发的动作电位的阈值降低。此外，在第二次戒酒后24小时，与对照组小鼠相应的神经元相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神经元的钙信号明显增强。这些结果表明，在小鼠形成依赖之前，戒酒期间投射到ACC的dCA1Glu神经元活动增加。免疫荧光染色显示，戒酒小鼠ACC中c-Fos的表达高于对照组动物。此外，在EW和对照组Thy1-YFP小鼠的脑片上进行的体外电生理记录显示，ACCGlu神经元的活性增强，放电率增加，电流诱发的动作电位的阈值相对于对照组小鼠降低。
为了在单细胞水平上观察ACCGlu神经元活动的变化，作者进行了活体双光子钙成像，结果显示，在第二次戒酒后24小时，ACCGlu神经元检测到的钙信号强度显著增加。为了检验在连续短期酒精消耗后戒酒对ACCGlu神经元对机械刺激的敏感性，随后应用光纤记录自由活动小鼠的钙信号，在第二次戒酒后24小时，戒酒小鼠右后爪接受0.07克von Frey细丝刺激后，ACCGlu神经元中的钙信号迅速增加。为了进一步确定机械刺激对ACCGlu神经元活动的影响，在ACC中注射了AAV-CaMKIIα-GCaMP6m病毒的自由活动小鼠上进行活体显微内窥镜记录 ACCGlu神经元的钙信号度。结果显示，在第二次戒酒后24小时，与对照组小鼠相比，戒酒小鼠的ACCGlu神经元的钙信号强度显著增加。这些结果表明，在小鼠发展成依赖之前，敏感化的ACC谷氨酸能神经元对短期饮酒戒断后具有重要作用。
总结：
作者的研究表明dCA1Glu到ACCGlu的神经回路在促进短期酒精消耗后戒断引起的痛觉过敏中发挥功能作用，这种非依赖性酒精消耗与疼痛敏感化的生理联系为大脑中不同神经系统之间错综复杂的网络相互作用提供了越来越多的证据，这些相互作用共同介导了酒精依赖的发展。